過表達(dá)慢病毒構(gòu)建

簡要描述：慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的病毒載體。對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一，并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。

更新時(shí)間：2024-10-26 00:00:00
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實(shí)驗(yàn)流程：

利用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性化載體。PCR 擴(kuò)增制備目的基因片段。所用擴(kuò)增引物在設(shè)計(jì)時(shí)需在其5'端添加同源重組序列(圖中以綠色和藍(lán)色標(biāo)記)，使用該引物擴(kuò)增目的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物5'和3'最末端的序列分別與線性化克隆載體兩末端序列完全一致。以線性化載體和目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物配制反應(yīng)體系，進(jìn)行重組反應(yīng),實(shí)現(xiàn)線性化載體和目的基因片段的體外環(huán)化。重組產(chǎn)物直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取平板上的單克隆進(jìn)行PCR鑒定,對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序及結(jié)果分析。將正確克隆菌液打大培養(yǎng)、抽提,獲得高純度質(zhì)粒,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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