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簡要描述：冷凍保種實驗服務(wù):冷凍保種（菌種/細(xì)胞凍存）是生物實驗室長期保存微生物（細(xì)菌、真菌、藻類等）或細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)，確保遺傳穩(wěn)定性和實驗可重復(fù)性
更新時間：2025-06-26 17:27:27
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微生物：細(xì)菌（如大腸桿菌、乳酸菌）、酵母（如畢赤酵母）、絲狀真菌、噬菌體等。
細(xì)胞系：哺乳動物細(xì)胞（如HEK293、HeLa）、干細(xì)胞、原代細(xì)胞等。
特殊樣本：難培養(yǎng)微生物（如厭氧菌）、基因編輯菌株（如CRISPR改造菌）。
| 項目 | 描述 |
|---|---|
| 標(biāo)準(zhǔn)凍存 | 使用甘油或DMSO凍存液，-80℃或液氮保存。 |
| 優(yōu)化凍存方案 | 針對脆弱菌種（如支原體）定制凍存保護劑。 |
| 復(fù)蘇驗證 | 凍存后復(fù)蘇，檢測存活率、污染及功能（如質(zhì)粒保留、基因表達）。 |
| 庫存管理 | 提供條形碼標(biāo)簽、電子數(shù)據(jù)庫記錄（凍存時間、位置、基因型等）。 |
| 快遞運輸 | 干冰或液氮罐運輸凍存管，確保全程低溫。 |
前處理：
培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600≈0.6-0.8）。
離心收集菌體，去除殘留培養(yǎng)基（避免冷凍損傷）。
凍存液制備：
常用保護劑：15-30%甘油（細(xì)菌）或10% DMSO（哺乳細(xì)胞）+培養(yǎng)基。
特殊配方：如海藻糖（提高真菌存活率）。
分裝與標(biāo)記：
分裝至凍存管（推薦1.5 mL螺口凍存管），標(biāo)注菌株名稱、日期、濃度。
冷凍程序：
梯度降溫：4℃ 30 min → -20℃ 1 h → -80℃長期保存（或直接液氮氣相）。
程序冷凍儀：精確控制降溫速率（如1℃/min，適用于敏感細(xì)胞）。
液氮保存：
轉(zhuǎn)移至液氮罐（氣相：-150℃至-196℃），避免液相中管爆裂。
快速解凍（37℃水浴，<1 min）。
涂板或液體培養(yǎng)，檢測：
存活率（CFU計數(shù) vs 凍前）。
遺傳穩(wěn)定性（PCR驗證目標(biāo)基因、質(zhì)粒保留率）。
污染檢測（無抗生素平板培養(yǎng)、16S rRNA測序）。
保護劑優(yōu)化：
細(xì)菌：甘油濃度需匹配菌種（如乳酸菌需20%甘油+5%脫脂奶粉）。
細(xì)胞：血清替代物（如HyClone FBS）減少批次差異。
冷凍速率：
快速冷凍（直接-80℃）適合多數(shù)細(xì)菌，慢速冷凍（程序降溫）適合真核細(xì)胞。
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 復(fù)蘇后無生長 | 保護劑濃度不當(dāng)或凍存液未混勻 | 重新優(yōu)化保護劑，渦旋混勻后再凍存。 |
| 細(xì)胞破裂 | 冰晶形成（降溫過慢） | 添加冷凍保護劑（如DMSO），程序降溫。 |
| 污染（真菌/支原體） | 凍存前樣本不純或操作污染 | 凍存前抗生素處理、PCR檢測。 |
-80℃：細(xì)菌通常2-5年，酵母1-3年（定期復(fù)蘇驗證）。
液氮：>10年（需避免溫度波動）。
干冰運輸：維持-78℃，適合短期（<3天）。
液氮罐：長期運輸需專業(yè)容器（如Taylor-Wharton液氮罐）。
風(fēng)險較低，但建議：
保存早期傳代菌株（避免累積突變）。
關(guān)鍵菌株備份多管（避免反復(fù)凍融）。
菌種鑒定：16S rRNA測序、MALDI-TOF質(zhì)譜分析。
專l保藏：協(xié)助提交至中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）或ATCC。
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